Exemplos de contaminações no cultivo in vitro

Lembro do meu começo de estágio no laboratório de cultura de tecidos e células vegetais, nas idas de 2002, me gabava na época por nunca ter deixado contaminar por microrganismos um frasco se quer, mesmo manipulando muitos frascos em uma mesma tarde de estágio, muitos digo quase 300 tubos de ensaios com bananas em uma tarde.

Era extremamente cauteloso, aquela coisa que a gente tem no começo de uma atividade.

Mas depois de alguns meses as contaminações por microrganismos foram ficando frequentes, mesmo aparentemente "fazendo tudo do mesmo jeito".

Mas, analisando melhor, não era tudo exatamente do mesmo jeito, alguns pequenos detalhes durante o trabalho fui deixando de lado, querendo agilizar o processo, e a falta desses detalhes foram suficientes para meu trabalho sofrer com algumas contaminações.

Meu pai diz algo parecido a respeito de dirigir moto: "moto é mais perigosa quando se perde o medo de andar com ela". Pois é, com o tempo fui perdendo parcialmente a preocupação com as contaminações, e elas vieram.

Com este post pretendo discutir alguns detalhes que deveriam ser lembrados durante a execução do cultivo in vitro de plantas para se diminuir as contaminações nos frascos.

Temos nossos agentes contaminantes principais as bactérias e os fungos, também os actinomicetos, que são próximos dos fungos, mas por eu não ser exatamente um especialista nesses organismos, os inclui em "fungos".

Primeiro vamos diferenciar uma contaminação por fungos por uma de bactérias, nas fotos abaixo temos dois casos de contaminações por fungos.










Agora ilustrando uma contaminação por bactérias:

Como devem ter notado ao clicarem em cima das fotos, no caso dos fungos as contaminações apresentam-se em um aspecto cotonoso, e no caso das bactérias o aspecto é leitoso. Quanto às colorações, são das mais diversas, em função da espécie do microrganismos e até da temperatura ambiente, algumas com coloridos que são até bonitos de se ver.

Alguém já deve ter esquecido a panela de feijão para fora da geladeira e notado no outro dia aglutinações com este aspecto leitoso que as bactérias proporcionam. Eu sempre esqueço.

Exato, os microrganismos estão por toda a parte, inalamos, ingerimos e expelimos seus esporos o tempo todo, mas estamos aqui hoje porque evoluímos para sermos resistentes a boa parte deles, mas quando eles encontram um ambiente altamente propício, sem alguma coisa que possa controlá-los, rico em nutrientes como o meio nutritivo de orquídeas ou o feijão cozido, eles proliferam em grande velocidade.

Podemos ver nas ilustrações com plantas em frascos contaminados, literalmente, as colônias de fungos e bactérias cobrindo as plantas, afinal em relação a elas as plantas crescem bem devagar, mas além deste abafamento, esses microrganismos liberam com seu crescimento diversos compostos tóxicos às plantas, além de enzimas (enzimas pectolíticas) que digerem as plantinhas, em outras palavras, as contaminações comerão o meio nutritivo e as plantinhas.

E as contaminações podem surgir porque os frascos e os meios nutritivos não foram devidamente esterilizados ou, durante a inoculação das plantas nos frascos alguns detalhes que passaram batidos.

Quanto a esterilização, o usual em laboratórios por aí é combinação de pressão, tempo e temperatura, ou seja, os frascos ficam submetidos a uma pressão de 1 atm, a 120 °C, por 20 minutos, em um equipamento denominado auto-clave, semelhante a uma baita panela de pressão. Esta combinação é importante para aumentar a eficiência da esterilização que, por exemplo, se fosse deixado de lado a pressão, em outras palavras uma esterilização a seco, em uma simples estufa, a combinação necessária de tempo e temperatura seria algo como algumas horas em temperaturas bem acima de 120 °C para obter o mesmo efeito de matar contaminações, o que não é desejável porque com este tratamento a solução nutritiva também se degradaria.

Lembram da pasteurização, e do tratamento UHT de leite de caixinha?

É viável deixar os frascos após o tratamento esterilizante descansarem por uma semana aguardando um possível surgimento de contaminações, o que ajudará a não perdermos tempo e plantas cultivando em ambientes já contaminados.

Nas situações a seguir, podemos notar que a contaminações bacterianas iniciram-se a partir das bordas dos potes de plástico. Isso poderia ter sido evitado utilizando-se potes mais limpos, sem um mínimo de poeira, a qual serve de proteção às estruturas de resistências das bactérias e de fungos.




















Agora vemos uma situação da contaminação iniciar-se de uma região mais central da superfície do meio nutritivo, que também poderia ter sido evitada estando em um ambiente mais limpo, com janelas fechadas diminuindo a movimentação de poeira no ambiente.




















Em poucos dias a situação evolui, e as contaminações passam a cobrir a área toda.











Dando sequencia, duas situações em que as contaminações vieram ao transplantar as plantinhas.




















Estas poderiam ter sido evitadas desinfestando melhor a superfície das ferramentas, deixando as pontas das mesmas mais tempo em contato com o fogo da lamparina, por exemplo, além de evitarmos respiração muito ofegante dentro da área de trabalho da câmara de fluxo laminar, evitar ficar passando as mãos acima do material de trabalho, pois destas podem desprenderem contaminações que atingirão o meio nutritivo, ou ainda, analisar mais cautelosamente o frasco do qual se extrairá as plantinhas, para ver se este já se encontra contaminado.

Abaixo uma ilustração de uma contaminação por um outro agente, no caso algas verdes. A contaminação por estas são raras, e aparentemente poderiam ser evitadas com as mesmas precauções supracitadas.


A próposito, existem técnicas que permitem o cultivo in vitro de plantas de uma maneira mais descomplicada, possível de se fazer em cima da pia da cozinha por exemplo, as quais já apresentei em alguns cursos que ministrei. Se alguém tiver interesse em aprender entre em contato comigo pelo meu email que se encontra ao lado e ajude um estudante falido...